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引物設(shè)計(jì)
細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是PCR中zui重要的一步。理想的引物對(duì)只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會(huì)同擴(kuò)增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個(gè)可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點(diǎn)：
1.典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列*性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。
2.選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。
3.設(shè)計(jì)5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會(huì)增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。
4.避免引物對(duì)3'末端存在互補(bǔ)序列，這會(huì)形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。
5.避免3'末端富含GC。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在zui后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。
6.避免3'末端的錯(cuò)誤配對(duì)。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
7.避免存在可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，這會(huì)破壞引物退火穩(wěn)定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物Tm值時(shí)并不包括這些序列，但是應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)。
有時(shí)候，對(duì)于引物設(shè)計(jì)僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計(jì)兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對(duì)，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用兼并堿基，因?yàn)?'端zui后3個(gè)堿基的退火足以在錯(cuò)誤位點(diǎn)起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因?yàn)樵S多兼并混合物中的引物不是特異性針對(duì)目的模板。
引物退火溫度
引物的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度。Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。
設(shè)定Tm有幾種公式。表4列出確定引物Tmzui常用的兩種方法。*個(gè)公式來(lái)源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。第二個(gè)公式根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tmzui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法。
根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會(huì)差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)。可以通過(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得*結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對(duì)的Tm差異如果超過(guò)5℃，就會(huì)引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比zui低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
遞減PCR
遞減PCR通過(guò)在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)緊的退火條件提高特異性。循環(huán)開在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低1℃到2℃，直到退火溫度低于Tm 5℃。只有同同源性zui高的目的模板會(huì)被擴(kuò)增。這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增，并會(huì)將擴(kuò)增的非特異性產(chǎn)物排擠出去。遞減PCR對(duì)于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法較為有用，如AFLP DNA指紋分析。
引物濃度
引物的濃度會(huì)影響特異性。*的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。
為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測(cè)量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過(guò)Beers法則（公式1）計(jì)算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使用公式2計(jì)算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的濃度必須使用計(jì)算的消光系數(shù)。這是因?yàn)橐镙^短，堿基組成差異很大。在Gibco/BRL定制引物的質(zhì)檢報(bào)告中包含了消光系數(shù)（OD/μmol）和消光系數(shù)的倒數(shù)（μmol/OD）。另外，不要使用寡聚核苷酸作為標(biāo)準(zhǔn)，在EB染色的膠上估算引物濃度，因?yàn)橐锖蜆?biāo)準(zhǔn)的染色能力根據(jù)序列不同而差異很大。
引物純度和穩(wěn)定性
定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對(duì)于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。因脫鹽而除去的苯甲酰基和異丁酰基很少，因此不會(huì)干擾PCR。部分應(yīng)用需要純化，以除去在合成過(guò)程中的任何非全長(zhǎng)序列。這些截?cái)嘈蛄械漠a(chǎn)生是因?yàn)镈NA合成化學(xué)的效率不是100％。這是個(gè)循環(huán)過(guò)程，在每個(gè)堿基加入時(shí)使用重復(fù)化學(xué)反應(yīng)，使DNA從3'到5'合成。在任何一個(gè)循環(huán)都可能失敗。較長(zhǎng)的引物，尤其是大于50個(gè)堿基，截?cái)嘈蛄械谋壤艽螅赡苄枰兓?nbsp;
引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。Life Technologies以一個(gè)zui小OD單位確保總寡核苷的產(chǎn)量。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。在TE重溶引物，使其zui終濃度為100μM。TE比去離子水好，因?yàn)樗膒H經(jīng)常偏酸，會(huì)引起寡核苷的水解。
引物的穩(wěn)定性依賴于儲(chǔ)存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）zui多可以保存2個(gè)月。
熱啟動(dòng)
熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性zui重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的*延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過(guò)程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受*，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR尤為有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡(jiǎn)單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能*消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。
熱啟動(dòng)通過(guò)抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動(dòng)方法十分煩瑣，尤其是對(duì)高通量應(yīng)用。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，入鎂離子或酶，包裹起來(lái)，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來(lái)并混合在一起。象手動(dòng)熱啟動(dòng)方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。 Platinum DNA聚合酶對(duì)于自動(dòng)熱啟動(dòng)PCR來(lái)說(shuō)方便。Platinum Taq DNA聚合酶的成分為復(fù)合有抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體的重組Taq DNA聚合酶。抗體在PCR配制，以至于在室溫的延時(shí)保溫過(guò)程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在變性步驟的94℃保溫過(guò)程中被釋放到反應(yīng)中，恢復(fù)了*的聚合酶活性。同經(jīng)化學(xué)修飾用于熱啟動(dòng)的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延時(shí)保溫（10到15分鐘）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃進(jìn)行2分鐘就可以恢復(fù)90％的Taq DNA聚合酶活性。
鎂離子濃度
鎂離子影響PCR的多個(gè)方面，如DNA聚合酶的活性，這會(huì)影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會(huì)影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。*的鎂離子濃度對(duì)于不同的引物對(duì)和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始濃度是1.5mM（注意：對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產(chǎn)量，但也會(huì)增加非特異性擴(kuò)增，降低忠實(shí)性。為了確定*濃度，從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進(jìn)行鎂離子滴定。為減少對(duì)鎂離子優(yōu)化的依賴，可以使用Platinum Taq DNA聚合酶。Platinum Taq DNA聚合酶能夠在比Taq DNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內(nèi)保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化.
促進(jìn)PCR的添加劑
退火溫度，引物設(shè)計(jì)和鎂離子濃度的優(yōu)化足以對(duì)大多數(shù)模板進(jìn)行高特異性的擴(kuò)增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影響DNA熔解溫度的添加劑提供了提高產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量的另外一種方法。為獲得的結(jié)果需要模板的*變性。另外，二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)阻止引物結(jié)合和酶的延伸。PCR添加劑，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿以及PCRx Enhancer Solution可以增強(qiáng)擴(kuò)增。它們可能的機(jī)理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。PCRx Solution還有其他優(yōu)點(diǎn)。在同Platinum Taq DNA聚合酶和Platinum Pfx DNA聚合酶一起使用時(shí)，僅需很少的鎂離子優(yōu)化。這樣，將Platinum技術(shù)同添加劑結(jié)合，增強(qiáng)了特異性，同時(shí)減少了第三種方法-鎂離子優(yōu)化的依賴。為獲得*結(jié)果，應(yīng)優(yōu)化添加劑的濃度，尤其是會(huì)抑制Taq DNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。
巢式PCR
使用巢式引物進(jìn)行連續(xù)多輪擴(kuò)增可以提高特異性和靈敏度。*輪是15到20個(gè)循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增。將一小部分起始擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100到1000倍加入到第二輪擴(kuò)增中進(jìn)行15到20個(gè)循環(huán)。或者，也可以通過(guò)凝膠純化將起始擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行大小選擇。在第二輪擴(kuò)增中使用一套巢式引物，其可以同*套引物內(nèi)側(cè)的靶序列結(jié)合。巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥瑑商滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列很少。而使用同樣的引物對(duì)進(jìn)行總數(shù)相同的循環(huán)（30到40）會(huì)擴(kuò)增非特異性靶位點(diǎn)。巢式PCR可以增加有*靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5' RACE）的特異性。
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