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這篇綜述重點(diǎn)說(shuō)明使用 RIPA 裂解液提取總蛋白以及下游實(shí)驗(yàn)中可能存在的問(wèn)題。
RIPA 裂解液常用于從脊椎動(dòng)物細(xì)胞和組織中提取總蛋白 [1]。但是由于蛋白質(zhì)間有較大的差異和非蛋白成份的干擾，所以從一個(gè)樣本中同時(shí)釋放和溶解所有蛋白質(zhì)是非常困難的。特別是一些整合到膜上的蛋白質(zhì)，或與其他蛋白質(zhì) / 核酸形成復(fù)合物時(shí)，就大大阻礙了提取效率。因此可以推斷，蛋白質(zhì)在提取過(guò)程中或多或少的與在體內(nèi)時(shí)情況不盡相同。
經(jīng)典 RIPA 裂解液中含有低濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS 變性劑），脫氧膽酸（干擾蛋白質(zhì)間相互作用）及其他成分。雖然 RIPA 裂解液經(jīng)過(guò)不斷改良使用，但是 RIPA 提取蛋白通常會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)不同的部分：即 RIPA 可溶組分和 RIPA 不可溶組分。 一般來(lái)說(shuō)，只有 RIPA 可溶組分被用于下游實(shí)驗(yàn)，而 RIPA 不可溶組分被丟棄。這樣提取的蛋白在使用中會(huì)存在哪些問(wèn)題呢？
先來(lái)看些文獻(xiàn)數(shù)據(jù)：
研究發(fā)現(xiàn)，不同的蛋白在 RIPA 裂解液中溶解性不同，例如 F9 中的纖維連接蛋白不溶于 RIPA 裂解液 [2] 。而小鼠額葉樣品中在 RIPA 可溶組分和非可溶性組分中含有相同量的 Septin 7 [3]（下圖），表明用 RIPA 裂解液提取這些特定蛋白質(zhì)的效率十分低。
近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者密切關(guān)注 RIPA 不可溶組分中的蛋白質(zhì)組分，以及它們對(duì)下游實(shí)驗(yàn)和整體數(shù)據(jù)的影響。Bai 和 Laiho 用 RIPA 裂解液從 Hela 細(xì)胞核中提取蛋白，發(fā)現(xiàn)可溶性組分和不可溶性組。
分的蛋白質(zhì)圖譜差異很大，表明蛋白質(zhì)的丟失不成正比 [4] （下圖）。
Mukhopadhyay 等 [5] 從突變小鼠的乳腺上皮細(xì)胞中提取總蛋白，發(fā)現(xiàn)在 RIPA 不可溶組分中，通過(guò) WB 很容易檢測(cè)到 EGFR, HSP90, c-Src, 和 tubulin，表明這些蛋白在 RIPA 不可溶組分中大量存在（下圖）。
Wang 等 [6] 對(duì)比 SDS 加熱法和 RIPA 裂解液法從斑馬魚肝臟腫瘤中提取蛋白，發(fā)現(xiàn) RIPA 裂解液提取這些樣品時(shí)對(duì)于大分子量蛋白的提取效率十分低（下圖）。
Li[7] 對(duì)比了從小鼠脾臟和肝臟中提取總蛋白 RIPA 可溶和不可溶性組分以及基于離心管柱法商業(yè)試劑盒提取的蛋白質(zhì)圖譜，發(fā)現(xiàn) RIPA 不可溶組分蛋白質(zhì)圖譜與可溶性組分圖譜相似，但是不*相同。這些丟失的不可溶組分覆蓋了整個(gè)蛋白質(zhì)圖譜分子量范圍，不同樣品的不可溶組分也有細(xì)節(jié)上的差異。不同樣品的蛋白質(zhì)丟失是不可預(yù)測(cè)的。然而，商業(yè)試劑盒提取蛋白不產(chǎn)生不可溶組分，更快速，可獲得更高產(chǎn)量更完整的蛋白質(zhì)圖譜（下圖）。
Ngoka [8] 用質(zhì)譜平行對(duì)比了幾組乳腺癌 RIPA 可溶組分和不可溶組分的蛋白質(zhì)圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用含尿素的裂解液提取 RIPA 不溶性組分中的平均分子量蛋白質(zhì)含量比可溶性組分高 60% 。換句話說(shuō)，許多大分子量蛋白質(zhì)被丟失在 RIPA 不可溶組分中。研究還表明，幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和許多細(xì)胞骨架蛋白被發(fā)現(xiàn)在 RIPA 不可溶組分里。這些結(jié)果表明，由于蛋白丟失在不可溶組分中產(chǎn)生了偏差, RIPA 提取蛋白的蛋白質(zhì)譜是不*的。
利用 RIPA 裂解細(xì)胞后一個(gè)主要用途是進(jìn)行目標(biāo)蛋白的定性和 / 或定量分析 [9,10,11]。zui近一篇綜述報(bào)道了影響定量免疫印跡的關(guān)鍵因素 [12]，在這項(xiàng)研究中，tubulin, lamin A, KRT5 顯示大量丟失在 RIPA 不可溶組分中。zui值得注意的是，組蛋白 H3K4me2 發(fā)現(xiàn)僅僅存在于 RIPA 不可溶組分中。轉(zhuǎn)錄因子 GATA-2 和黏附分子β-catenin 也出現(xiàn)在不可溶組分中。研究中的另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是樣品制備方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響。Janes [12] 對(duì)比了 NP-40，RIPA 裂解液和 Laemmli 裂解液的作用，用 WB 檢測(cè)切割形式的 caspase-8，發(fā)現(xiàn)使用 Laemmli 裂解液的樣品中可以檢測(cè)到，而使用 RIPA 裂解液樣品中沒(méi)有檢測(cè)到，證實(shí)了 RIPA 裂解液不適合用于這類型的分析。
利用 RIPA 裂解液提取的蛋白還被發(fā)現(xiàn)會(huì)人為的增加了某些蛋白激酶的活性。用 RIPA 裂解液裂解結(jié)腸癌細(xì)胞比用 NP-40 裂解后體外蛋白酶活性升高了 5-7 倍 [13]。Zapata[14] 等人，對(duì)比用 RIPA 和 2%SDS 提取活化的 T 淋巴細(xì)胞 caspase 的活性，發(fā)現(xiàn) RIPA 裂解液通過(guò)釋放 GraB 人工激活 caspase-3。這些結(jié)果強(qiáng)烈建議大家在使用 RIPA 裂解液時(shí)要做好應(yīng)對(duì)數(shù)據(jù)解讀的預(yù)案。
如上所述，使用 RIPA 裂解液提取總蛋白由于蛋白的丟失會(huì)產(chǎn)生很多問(wèn)題。
就總蛋白而言，提取過(guò)程中
(1) 丟失的蛋白會(huì)引起蛋白圖譜的變化
(2) 改變不同種類蛋白的比例
(3) 改變某些蛋白的活性。
下游實(shí)驗(yàn)中可能存在的問(wèn)題：
（1） 使用 RIPA 裂解液提取蛋白做 WB 會(huì)人為的增強(qiáng)或降低某些信號(hào)強(qiáng)度。RIPA 裂解液提取蛋白已經(jīng)被證實(shí)有 10-30% 的蛋白會(huì)丟失在不可溶組分中 [12]。
（2） 如果一個(gè)細(xì)胞 / 組織樣品中某些特定的蛋白質(zhì)可以在可溶組分和不可溶組分間轉(zhuǎn)變，或者像上面所述受激活狀態(tài)影響 [12] 的情況下，數(shù)據(jù)的解釋可能成為一個(gè)大問(wèn)題。
（3） RIPA 裂解液提取的蛋白不適合用于目標(biāo)蛋白的定性和 / 或定量分析。
理想的總蛋白提取應(yīng)該是什么樣的呢？
（1） 獲取給定樣品中完整的蛋白質(zhì)圖譜，要真實(shí)的反映所有蛋白質(zhì)種類和比例。大多數(shù)研究人員認(rèn)為他們采用的總蛋白提取方法已經(jīng)反映了體內(nèi)目前的情況，但是很少有人真正的通過(guò)平行實(shí)驗(yàn)對(duì)比不同的提取方法。在許多情況下，很可能真實(shí)的蛋白質(zhì)圖譜和研究者相信的結(jié)果不*相同。
（2） 獲取zui大的蛋白質(zhì)溶解度，zui少的蛋白質(zhì)損失以及得到完整的蛋白質(zhì)圖譜才是蛋白質(zhì)提取zuijia的選擇。
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